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酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)

一，酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)的原理

由于醋酸纖維膜是由醋酸纖維素組成的，對蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)幾乎無阻力，差不多所有在電場中能泳動(dòng)的物質(zhì)均能在醋酸纖維膜里自由移動(dòng)，因此在免疫電泳中，醋酸纖維膜是一優(yōu)良的載體。將酶標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原在醋酸纖維膜進(jìn)行電泳，生成免疫復(fù)合物，用酶底物顯色，能大幅度地提高檢測的靈敏度和可靠性。使用酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)（Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,簡稱ELCAIE），筆者文章公布的檢出量是0.3ng的RMV，其實(shí)當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)顯示0.1ng的RMV檢測量。

二，酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)的程序（檢測RMV）

1,器材與設(shè)備

（1）電泳儀（包括電泳槽）；

（2）醋酸纖維膜（10cm×14cm,厚度10dmm；

（3）微量進(jìn)樣器；

（4）竹鉗。

2，材料與試劑

（1）       以0.2mol/LpH7.2硼酸緩沖液連續(xù)稀釋的RMV溶液（10ng/ml→1×10⒌ng/ml）；

（2）       HRP標(biāo)記的RMV免疫的兔IgG（戊二醛一步法交聯(lián)）；

（3）       洗滌液，每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥緩沖液和85g食鹽，其余為蒸餾水；

（4）       底物與供氫體溶液（H2O2和DAB－4HC1）；

（5）       0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液。

 3，實(shí)驗(yàn)程序

（1）       將醋酸纖維膜用軟鉛筆輕輕劃好點(diǎn)樣線，酶標(biāo)抗體樣點(diǎn)距膜邊3cm,抗原樣點(diǎn)與酶標(biāo)抗體樣點(diǎn)對距3cm,兩個(gè)樣點(diǎn)橫距1.5cm.

（2）       將上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液中浸濕，取出薄膜，用濾紙吸去表面水分，但不要干燥。

（3）       用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣，抗體每樣點(diǎn)用酶標(biāo)抗體液10ul,抗原樣點(diǎn)*點(diǎn)是對照，滴加10ul健青菜蛋白溶液；第二、三、四、五樣點(diǎn)滴加RMV抗原溶液各10ul,濃度分別為1×10⒌ng/ml、1×10⒋ng/ml、1×10⒊ng/ml、100ng/ml；第六、七樣點(diǎn)分別滴加5ul、3ul、，濃度為100ng/ml；第八樣點(diǎn)滴加10ul,濃度為10ng/ml；第九樣點(diǎn)滴加5ul,濃度為10ng/ml.

（4）       點(diǎn)樣完畢，將薄膜置于電泳槽中央棱邊，使其架空，然后用濾紙作鹽橋，電泳緩沖液為0.1mol/L PH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液，抗原端接負(fù)極。

（5）       待作為鹽橋的濾紙全部濕潤后，接通電源，控制電壓150V，電泳時(shí)間1.5h左右。

（6）       電泳完畢，將薄膜浸洗在洗滌中過夜。

（7）       次日將薄膜在清水中漂洗3－5min后取出。

（8）       zui后滴加H2O2（0.3%）和DAB－4HC1溶液，各占一半量，幾分鐘內(nèi)就會顯示結(jié)果。